东方美食也不受朗伯-比尔定律限制; 而酶标显色测定属吸收光谱分析

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  临床检验中的发光免疫分析讲解_职业技术培训_职业教育_教育专区。临床检验中的发光免疫分析讲解

  临床检验中的发光免疫分析 原理、优势和值得注意的问题 杨晓林 北京大学医学部研究员 中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员 国际生物发光和化学发光学会( ISBC)学术理事 Council member of scientific advisory board of International Society on Bioluminescence & Chemiluminescence 发光(Luminescence) 化学发光(Chemiluminescence) 生物发光(Bioluminescence) ? 由于化学反应(通常是氧化)或生物化学反应产生电 子能级处于激发态的物质,后者通过跃迁释放能量并 产生光子,从而导致的发光现象。与荧光最大的区别 在于无需激发光,因此后者也被称为光致发光。 ? 生物发光和化学发光均属于冷光,即发光不是由于发 光体温度升高所致,因此其反应能量绝大部分用于发 光而不是发热,发射波长也与温度无关。 ? 发光测定属发射光谱分析,多采用动力/速率法或积分 法,无需终止反应,也不受朗伯-比尔定律限制; 而酶标显色测定属吸收光谱分析,多采用终点法,需 终止反应,并受朗伯-比尔定律限制。 化学发光的分类 按化学反应类型 ? 酶促化学发光: 辣根过氧化物酶系统 碱性磷酸酶系统 黄嘌呤氧化酶系统 按发光持续时间 ? 闪光(Flash): 发光时间在数秒内,如吖啶酯 以原位进样(In Situ Injector) 和时 间积分法测量 ? 非酶促化学发光: 吖啶酯系统 草酸酯系统 三价铁-鲁米诺系统 ? 辉光(Glow): 发光时间在数十分钟以上,如: HRP-Luminol系统 AP-AMPPD系统 黄嘌呤氧化酶系统 无须原位进样、 以速率法测量。 闪光与辉光及其测量方式的差别 闪光尖峰 发光信号 积分法测量 辉光坪区 速率法测量 原位进样 时间 商业化产品中常见的化学发光系统(一) 鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统 O H2 O 2 + NH2 O NH HRP NHOHN2 NH2 CO2+Photon (425nm) CO2- 增强剂(Enhancer) OH R N R B OH OH R OH S 商业化产品中常见的化学发光系统(二) O O OCH 3 AP O O OCH 3 OPO32O OOCH3 AMPPD及其衍生物 的化学发光系统 O * 光子(477nm) + O- 商业化产品中常见的化学发光系统(三) CH3 N+ CH3 N CH3 N + H 2O 吖 啶 酯 化 学 发 光 系 统 OHH+ H2O2 C=O O HO C=O O HOO C=O O R R CH3 N 光子 + CO2 + O O R CH3 N + C=O O R OH 发光检测的剂量--反应关系曲线 信号强度(Y) 理论/校正曲线 实际曲线 由于:不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线 因此:科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键 标记物浓度(X) 发光信号检测 光敏二极管、光敏电池、光电偶合器(CCD) 原理: 光信号 光电转换器件 电压或电流信号 放大 主要特点 ? 结构简单、性能稳定 ? 但灵敏度低、线性范围较窄。 单光子计数器是目前高灵敏度 发光分析仪的核心部件 激发光阴极 产生光电子 在各打拿极之间得到 能量和数目的倍增 在阳极上形 成较强信号 发光样品 产生光子 光电倍增管 高 压 高速分频器 高速比较器 高速放大器 相对发光单位 数字脉冲(RLU) 脉冲信号 单光子计数器的工作特性 光子计数(Y) 理论/校正曲线 由于:单光子计数是在检测随机光子事件 因此:随光子数量增多检测效率持续下降 所以:准确的校正技术是设备品质的关键 饱和点 实际计数曲线 模拟(光电流)测量曲线 发光强度(X) 单光子计数式发光检测仪 单光子计数器 计数/贮存器 打 印 机 程控高压 样品运动/定位装置 原位注射泵 控制器 计 算 机 程控自动门锁及检测装置 发光仪执行模块 发光仪控制模块 光生物学技术的应用范围 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 军事侦测 公安稽查 卫生检疫 药物筛查 医学诊断 环境检测 航天遥感 生命科学 …… 已成为现代生物技术最活跃的领域之一 光生物学检测技术的优越性 ? ? 彻底消除了放射性危害 无半衰期限制,试剂稳定性和有效期大大延长 ? ? ? ? 容易实现连续、动态、重复测定 适合于复合标记系统进行多指标并行测定 操作简单,反应速度快,容易实现自动化 灵敏度和线性范围超过以往技术 几种标记/检测技术理论极限灵敏度的比较 灵敏度(mol/L) 10-18 10-15 10-12 10-9 酶标 荧光 放免 发光 几种标记/检测技术理论线 酶标 荧光 放免 发光 几种标记/检测试剂的有效期比较 有效期(月) 18 15 12 9 6 3 0 酶标 荧光 放免 发光 试剂盒 仪器 100,000 人民币 人民币 特殊防护 治理污染 80,000 60,000 40,000 20,000 0 放免 酶标 发光 三种免疫测定技术的成本及费用 三种免疫测定技术的成本及费用 夹心法的剂量--反应关系曲线 信号强度(Y) 分析灵敏度(最低检测限)(95%可信度): S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。东方美食 功能灵敏度: 测定误差(变异)≤20%的最低可检测浓度。 线性范围: (分析)功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度 相关系数≥0.99的曲线范围 Hook(前滞)效应 线性范围 待测物浓度(X) 竞争法的剂量--反应关系曲线 信号强度( Y ) 分析灵敏度(最低检测限)(95%可信度): S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值 功能灵敏度: 测定误差(变异)≤20%的最低可检测浓度 线性范围: (分析)功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度 相关系数≥0.99的曲线范围 线性范围 待测物浓度( X ) 发光免疫分析技术 的现状及应注意的问题 商品化光生物学标记检测技术性能比较 技术类型 标记、反应体系 酶 促 过氧化物酶、鲁米 诺、氧化剂、增强 剂等 螺旋金刚烷环氧化 物、碱性磷酸酶 非 酶 促 时间分辨荧光 吖啶酯、过氧化氢 主要优点 测量方式简单(速率 法)成本较低、灵敏 度较高 测量方式简单(速率 法)灵敏度较高 灵敏度较高 试剂成本高、发光时间短测量方式复杂(积 分法)需原位进样(In Situ Injector)仪器 成本及维护费用较高试剂成本较高 测量方式复杂(脉冲激发、间歇式测量、流 动池)仪器成本及维护费用高环境及样品中 同类元素可导致本底干扰 主要不足 工作曲线随时间漂移低端斜率呈非线性下移 化 学 发 光 铕(Eu)、镝(Dy)、 灵敏度较高、试剂较 钐(Sm)、铽 稳定 (Tb)、等络合物 脉冲光源激发 钌(Ru)的络合物脉 冲电场激发 电化学发光 ?化学发光:Chemiluminescence ?时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)Time Resolved Fluorescence(Time Delayed Photoluminescence) 标记物为稀土元素络合物,通常采用解离增强荧光免疫分析(DEFIA) ?电化学发光(也称场致发光)Electrochemiluminescence(Electroluminescence)标记物为稀土元素络合物 商品化发光免疫分析产品的某些宣传误区 某些产品宣称的灵敏度远超过免疫反 应的理论极限——10-19mol/L 即:六个待测物分子/ 100ul样品 所以,片面宣扬检测技术灵敏度和线性 范围的强弱,不仅毫无意义,而且也是 荒谬的。东方美食 就发光分析而言,制约灵敏度的瓶颈 在于抗体亲合力和干扰因素,而不是 检测技术。 抗体筛选、干扰屏蔽,生产工艺、管理 水平和技术服务是决定产品性能的关键 例如:电化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.005mIU/L 第四代化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.001mIU/L 原因在于抗体的亲合力,而不是检测技术。 抗体选择——胰岛素 多抗或无选择性单抗 免疫源性胰岛素 胰 岛 素 胰 岛 C肽 胰岛素原 素 针对掩蔽性抗原 胰 岛 素 真胰岛素 抗体选择——HCG (TSH、PRL、LH、FSH类似) 多抗或无选择性单抗 普通HCG β 亚 单 位 α 亚 单 位 α 亚 单 位 β 亚 单 位 α 亚 单 位 X α亚单位特异 β 亚单位特异 针对掩蔽性抗原 β HCG α β 亚 亚 单 单 位 位 β 亚单位特异 β 亚单位特异 β HCG游离亚单位 抗体选择——游离PSA 总PSA PSA ?针对非掩蔽性抗原 ?与结合和游离PSA等分子结合 PSA 结合蛋白 针对掩蔽性抗原 游离PSA 小分子性激素测定方法的进展 男女性激素和皮质激素均来源于共同的前体和合成、代谢途径,其 结构也非常相似;而且普遍与血清中的某些蛋白结合。 因此,皮质功能紊乱、肝肾功能紊乱、某些遗传缺陷、血清蛋白异 常、服用类固醇药物等均可造成这些激素测定结果的异常。 消化样品 ↓ 萃取有机相 ↓ 分子筛柱分离各类甾体 ↓ 测定 减少—— 结合蛋白 类似物 前体 代谢产物 ——干扰 血清直接测定 + 高特异性单抗 + 结合蛋白屏蔽技术 经典方法 直接测定法 游离甲状腺激素测定方法的进展 常见甲功指标:TSH、FT3、FT4、TT3、TT4 对甲亢的诊断价值依次为:TSH=FT3>FT4>TT3>TT4 对甲低的诊断价值依次为:FT4=TSH>TT4>FT3>TT3 但FT3 、 FT4灵敏度要求高,且易受干扰 发光法提高了灵敏度,使得其临床应用普遍性超过TT4和TT3 第一代(放免) 两步法 操作时间长 灵敏度差 准确性差 第二代 类似物法 操作时间短 灵敏度较好 准确性较好 血清FT3 、 FT4试剂盒的发展 (消除结合蛋白对测定的影响) 测定游离激素的参考方法(“金”标准):平衡透析法(透析液过多可导致测值偏高) 操作复杂、采样量大,不适于临床常规 第三代 反向竞争法 (标记抗体) 操作时间短 灵敏度更好 准确性更好 游离激素测定法的试金石——稀释实验 以游离T4为例,样品稀释20倍以内测值无明显变化 (应扣除实验本身对样品的稀释度并注意基质效应,建议用6-8%BSA稀释) FT4 + TBG 游离 T4 游离结合蛋白 K T4TBG 结合常数 结合T4 其中:K= [T4TBG] [FT4] [TBG] (固定常数,不变) 由于绝大部分T4呈结合状态,因此:[T4TBG]≈[TT4](总T4); [TBG]≈[总TBG]-[TT4] 故, K≈ [TT4] [FT4] ([总TBG]-[TT4]) 即, [FT4]≈ [TT4] K([总TBG]-[TT4]) 所以,样品被稀释N倍后, [FT4]≈ [TT4]/N K ([总TBG]/N-[TT4] /N) = [TT4]/N 相 同 [TT4] = K([总TBG]-[TT4]) K ([总TBG]-[TT4])/N 发光技术—— 临床免疫分析划时代的进步 普通放免 功能灵敏度1-2mIU/L 基本无法测到正常值 固相放免 功能灵敏度 0.1-0.2mIU/L 发光免疫 功能灵敏度 0.01-0.02mIU/L 新型发光免疫 功能灵敏度 0.001-0.002mIU/L 下限以下的血清TSH 对甲亢的诊断意义不大 在甲亢的诊断中 开始发挥作用 成为甲亢诊断的 首选指标之一 更新了部分临床概念 改写了甲功的调控理论 第一代 TSH检测试剂盒 第二代 TSH检测试剂盒 第三代 TSH检测试剂盒 第四代 TSH检测试剂盒 以TSH(促甲状腺素)为例 目前商品化发光免疫分析产品的几个特点 ? 大多采用全自动工作方式,部分采用微孔板半自动方式 ? ? ? 多采用磁性或非磁性微粒包被,以增加表面积,使反应时间缩短 使用内建标准曲线加校正的办法产生工作曲线 部分产品采用流动池测定方式(适合于闪光型发光或电化学发光) 流动池检测方式示意图 冲洗液 干燥空气 检测器 负压泵 四通阀 检测池 废液 计量泵 氧化剂 样品管 原位进样泵 优点:结构简单,运行成本低 缺点:易产生交叉污染,工作效率受限 标准化——自动化免疫分析系统对试剂盒的技术要求 ? 对仪器的要求:结构简单、运行效率高、故障率低、维护费用少 ? 对试剂盒的相应要求:标准化、成套化、简单化,具体为: 反应/洗涤/测定条件一致;操作步骤少且趋于一致 反应时间短; 通用成分多、专用成分少 措施 ? 统一标记/检测系统 ? 重新优化并统一反应/洗涤/测定条件和操作步骤 ? 改变包被模式: 微粒包被:反应效率↑,反应时间↓;散射干扰↑ 、离子干扰↑ (磁珠) 间接包被:反应效率↓,反应时间↑;散射干扰↓ 、检测效率↑ 注意内源性物质干扰!(生物素-亲合素系统) 微粒+间接包被: 间接包被夹心法原理 标记抗体 待测抗原 俘获抗体 结合配体 间接包被物 包被体 特点:所有试剂盒均采用同一包被物和结合配体 工作曲线的特点与校正原理 工作曲线四要素 ?拟合方式:描述曲线基本形状,取决于实验模式和剂量-效应关系走向。 ?截距:描述曲线位置,修正依据为本底信号和系统误差,修正后导致曲线平移。 ?斜率:描述曲线俯仰角度,修正依据为结合/反应/检测效率。修正后导致曲线旋转。 ?变形因子:调整曲线形状(取决于抗体活性和特异干扰因素变化) 信 号 强 度 ( Y) 平移 基本形状 旋转 变形 待测物浓度(X) 常见拟合方式的性质及其参数的含义 拟合方式 拟合方程 剂量-反应关系 性质 斜率 截 距 变 形 线性 对数 logLogit 四参数 三次曲线 Y=A*X+B Log[(Y-N)/(Y0-N)] =A*logX+B ln[P/(1-P)]= A*lnX+B P=(Y-N)/(Y0-N) Y=(D-C)/[1+(X/A)B]+C Y=A*X3+B*X2+C*X+D Y=A*X+B Y= (Y0-N) * 10B*XA+ N Y =(Y0-N) * eB*XA/(1+ eB*XA) + N Y=(D-C)/[1+(X/A)B]+C Y=A*[X3+(B/A)*X2+(C/A)*X]+ D 直线-N D-C A B N N C D / A A B A B B/A C/A X:待测物浓度; Y0:零浓度样品信号强度; Y:信号强度; N:非特异结合信号强度(NSB) 漂亮的拟合曲线决不是实验结果准确的唯一保证!!! 定值/非定值质控血清才是监控数据可靠性的主要手段!(谨防作弊软件) 使用商品化发光免疫分析产品 可能遇到的几个问题 ? ? ? 与以往方法(放免等)在检测指标的正常值及临床意义上的差异。 如:免疫源性胰岛素与真胰岛素、HCG、性激素等 采用不同的单抗或多抗时检测结果也有较大差异。 (单抗特异性好,受干扰小,因此测值低) 不同厂家产品测定结果之间一致性差(未与国家标准品比对)。 ? ? 所使用的内建标准曲线结合校正的方法不尽完善。 部分产品不显示原始数据,无法监控其准确性。 免疫分析结果的干扰因素 温度 金属离子 本底物质 结合蛋白 (测定小分子) 防腐剂 杂质 氧化剂 还原剂 磁场 光线 同一干扰因素对不同检测方法的不同影响 洗 涤 祛 除 离心沉降 免放或 发光法 放免法 待测物 TBG 标记抗原 包被(结合)抗体 以甲状腺素结合蛋白(TBG)干扰竞争法测定T3为例 使用商品化发光免疫分析产品 必须做好的几个工作 ? ? 在厂家提供的数据基础上,自行建立正常参考值系统。 明确各个试剂盒的特异性及交叉反应情况 如:小分子激素之间,以及与自身前体或代谢物之间的交叉 胰岛素与C-肽、胰岛素原之间的交叉 FSH、LH、HCG之间的交叉。 ? ? 充分利用现有国标参考品校正结果(注意防腐剂干扰) (可以从国家药品生物制品检定所或临床检验中心得到) 自行建立多点质控(2-3点)监控每次实验的准确性。 尽可能避免干扰因素 采样:清洁样品管(防止还原剂干扰)、不使用酶抑制剂、及时送检 实验室:恒温、避免强光和强磁场、严格操作规程、及时维护、报修 正常值参考的意义及灰色区域的存在 如果测定结果处于灰色区域(约在正常值上下限以内20%)内, 则需要进一步追踪检查。 95%或99% -20% +20% 自身基础数据 ——最佳“正常参考值” 对于患者来讲,最佳的参考值是自己以往的测定数据,即自身对照; 因此积累病人的基础数据非常重要。 FSH 尤其是性激素、生长激素、胰岛素等具有周期性分泌或释放规律的激素。 某一患者变化规律 (无排卵峰) 正常人平均值变化规律 正常参考值范围 时间 卵泡期 排卵期 黄体期 月经期 低发病率疾病的筛查指标用于普通人群 产生的巨大“困惑” 灵敏度(真阳性率):对真阳性病例的检出率,即=检出阳性病例数/总受检阳性病例数 特异度(真阴性率):对真阴性病例报阴性的比率, 即=报阴性结果数/总受检正常人数 若某肿瘤筛查法的指标达到理论极限,即灵敏度100%,特异度99%(正常值为99%可信限) 而肿瘤的发病率多在十万分之三十以下,因此其应用于正常人群体检时,总阳性病例可能为: 30+(100,000-30)×(1-99%)=30+999.7≈1030; 其中,假阳性率=999.7/1030 × 100%=97% 绝大部分为假阳性!!! 因此,筛查指标的意义在于高危人群的早期预警,而决不是疾病确诊! 改进办法:采用多个厂家的产品或多指标联合测定(艾滋、肿瘤) 串联实验:多个检测均阳性才定为阳性,假阳性(误诊)↓,假阴性(漏诊)↑ 并联实验:一个指标阳性就定为阳性,假阳性(误诊)↑ ,假阴性(漏诊)↓ 取舍原则:分别对误诊和漏诊带来的医学、经济、社会、伦理风险综合分析平衡 化验结果与临床不符的原因 原因 操作失误、 仪器故障、 试剂失活等因素 一步夹心法测值低 可能存在前滞效应 解决 排除这些因素后 重复测定或重复送样 用同试剂盒的校准品A 稀释后再重新测定 及时与临床沟通 结合说明书综合判断 用小鼠血清稀释样品 找厂家索取拮抗剂 药物以及其它 基础疾病的干扰 所有夹心法均强信号 往往存在异嗜性抗体 由于个体差异或不明干扰因素的存在,总有少数病例的化验结果与其临床表现不符 不同实验方法, 或同一方法的不同厂家产品之间, 其测定结果和临床正常值都会有所差异 在厂家提供的正常参考值基础上 建立自己的正常参考系统 不同实验室环境和不同人群条件下, 其测定结果和临床正常值也会有所不同 及时采样、送检, 实验室及时完成化验, 严格按照试剂盒说明书要求存放 待测物的降解及其与血清蛋白结合状态的改变 检测结果受标本存放时间及条件的影响 感谢各位捧场! 欢迎批评指正!

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